Novo antígeno | Medidor de vazão Tianjin Co., Ltd

Nature volume 610, páginas 752–760 (2022)Cite este artigo

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Estabelecer e manter a tolerância a autoantígenos ou antígenos estranhos inócuos é vital para a preservação da saúde do organismo. Dentro do timo, as células epiteliais medulares do timo (mTECs) que expressam o regulador autoimune (AIRE) têm um papel crítico na autotolerância através da deleção de células T autorreativas e da promoção do desenvolvimento de células T reguladoras do timo (Treg) . Dentro de semanas após o nascimento, uma onda separada de diferenciação de células Treg ocorre na periferia após exposição a antígenos derivados da dieta e da microbiota comensal5,6,7,8, mas os tipos de células responsáveis pela geração de células Treg periféricas (pTreg) têm não foi identificado. Aqui descrevemos a identificação de uma classe de células apresentadoras de antígeno RORγt + chamadas células Thetis, com características transcricionais de mTECs e células dendríticas, compreendendo quatro subgrupos principais (TC I – TC IV). Descobrimos uma onda de desenvolvimento de células Thetis nos gânglios linfáticos intestinais durante uma janela crítica no início da vida, coincidindo com a onda de diferenciação de células pTreg. Enquanto TC I e TC III expressaram o fator nuclear mTEC AIRE, o TC IV não possuía expressão de AIRE e foi enriquecido para moléculas necessárias para a geração de pTreg, incluindo a integrina αvβ8 ativadora de TGF-β. A perda do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHCII) ou ITGB8 pelas células Thetis levou a um profundo comprometimento na diferenciação intestinal de pTreg, com subsequente colite. Por outro lado, a expressão de MHCII pelas células linfóides inatas do grupo 3 RORγt + (ILC3) e pelas células dendríticas clássicas não foi suficiente nem necessária para a geração de pTreg, implicando ainda mais o TC IV como a célula tolerogênica apresentadora de antígeno RORγt + com uma função essencial no início da vida. Nossos estudos revelam caminhos paralelos para o estabelecimento de tolerância a antígenos próprios e estranhos no timo e na periferia, respectivamente, marcados pelo envolvimento de programas celulares e transcricionais compartilhados.

No timo, uma linhagem distinta de células epiteliais estabelece tolerância a antígenos próprios através da deleção de células T autorreativas e da promoção da diferenciação de células Treg1,2,3,4. Estas funções dos mTECs são mediadas em parte pela expressão de AIRE, que regula a expressão ectópica de antígenos restritos a tecidos1. Outro local importante de indução de tolerância reside no tecido linfóide intestinal, onde o sistema imunológico em desenvolvimento de uma criança é exposto a muitos novos componentes dietéticos e a micróbios colonizadores após o desmame. Estabelecer uma relação harmoniosa entre hospedeiro e microbiota nesta janela de desenvolvimento no início da vida é fundamental para prevenir o aparecimento posterior de distúrbios imunomediados7,9. Central para o estabelecimento da tolerância aos micróbios intestinais é a diferenciação de células T virgens em células Treg geradas perifericamente (pTreg) após encontro com antígenos derivados comensais5,6,10,11. No entanto, a identidade da célula apresentadora de antígeno (APC) que promove a diferenciação de células pTreg não é conhecida. A estreita janela de tempo para estabelecer a homeostase imunológica intestinal sugere a presença de uma APC tolerogênica restrita ao desenvolvimento dentro do nicho intestinal neonatal.

Células pTreg extra-tímicas, diferenciadas de suas contrapartes tímicas pela expressão do receptor nuclear órfão RORγt, surgem em linfonodos mesentéricos (mLN) em resposta a antígenos bacterianos comensais e têm um papel crítico na supressão de respostas imunes inflamatórias contra micróbios intestinais6,11. Por outro lado, camundongos deficientes na apresentação de antígenos restritos a MHCII pelas células RORγt + (MHCIIΔRORγt) desenvolvem inflamação intestinal grave porque não estabelecem tolerância a bactérias comensais, sugerindo uma conexão potencial entre RORγt + APCs e geração de células RORγt + pTreg. Para abordar esta possibilidade, analisamos camundongos MHCIIΔRORγt com três semanas de idade, quando as células pTreg se acumulam no intestino . Observamos uma redução acentuada nas células RORγt + pTreg dentro do mLN e da lâmina própria do cólon, juntamente com uma expansão das células efetoras CD44hi T (Teff) (Fig. 1a-d e Extended Data Fig. 1a). Às oito semanas de idade, esses camundongos exibiram uma redução severa e sustentada nas células RORγt + pTreg juntamente com a expansão das células T auxiliares 17 (TH17) do cólon (Fig. 1e e Dados Estendidos Fig. 1b), em linha com estudos anteriores demonstrando um proeminente papel das células RORγt + pTreg específicas do patobionte na supressão de células TH17 inflamatórias11. A análise histológica demonstrou colite grave com acentuado infiltrado de células inflamatórias, ulceração da mucosa e perda de criptas (Fig. 1f, g), confirmando um papel crítico para RORγt + APCs na prevenção de respostas imunes intestinais desreguladas.

1.5, adjusted P < 0.01) for each Thetis cell cluster. h, Dot plot showing expression of selected cell-surface markers that are differentially expressed between Thetis cell subsets. i, Gating strategy for identification of Thetis cell subsets. j, Intracellular expression of AIRE protein by Thetis cell subsets; each symbol represents an individual mouse (n = 4). k, summary of TC I–TC IV phenotypes. Plots in i are representative of n = 6 mice from 3 independent experiments. Data in b,e,j are representative of 3 independent experiments. Box plots in c indicate median (centre line) and interquartile range (hinges), whiskers represent minimum and maximum values, and dots represent outliers./p>

50,000 cells (viability 95%) were lysed for 4 min and resuspended in Diluted Nuclei Buffer (10x Genomics, 2000207). Lysis efficiency and nuclei concentration was evaluated on Countess II automatic cell counter by trypan blue staining. Nuclei (9,660 per transposition reaction) were loaded, targeting recovery of 6,000 nuclei after encapsulation. After the transposition reaction, nuclei were encapsulated and barcoded. Next-generation sequencing libraries were constructed following the manufacturer’s instructions, and were sequenced on an Illumina NovaSeq 6000 system./p>

1,000 and < 50,000), the number of detected genes (>500 and < 6,000), and the fraction of mitochondrial transcripts (<15%). Barcodes were further filtered based on the number of scATAC-seq fragments (3.5 < log10(number of fragments) < 4.5) and transcription start site enrichment score (>4). Arrow files were created from the scATAC-seq fragments using ArchR v1.0.154, and doublets were identified and removed with default parameters. Finally, any genes detected in <2 cells in the scRNA-seq data were discarded, leaving 20,779 genes. After clustering, the scRNA-seq data (described in ‘Dimensionality reduction, cell clustering, and visualization’), and based on the expression of marker genes, we identified 5 minor contaminant clusters (glial cells; cluster 17, plasmacytoid dendritic cell; cluster 18, Rorc–/lo CCR7+ dendritic or Thetis cell; cluster 19, mixed monocyte/cDC1; cluster 20, and macrophage; cluster 21) which were excluded from downstream analyses. In total, 10,145 cells remained, with a median scRNA-seq library size of 3,150 and a median of 13,885 scATAC-seq fragments./p>50,000), number of detected genes (>1,300), and the fraction of mitochondrial transcripts (<8%). Finally, genes detected in <2 cells were discarded. A total of 481 cells remained, with a median library size of 924,319 from 27,195 genes./p>1.5) and adjusted P value (<0.01). Ribosomal and mitochondrial genes were removed from the final list of genes reported or visualized. Where stated, the top DEG markers were subsequently selected for each group, based on fold change./p>

1.3, adjusted P < 0.01) comparing the scRNA-seq clusters in a one-vs-rest test, that were also expressed in the microarray data. The proliferating and progenitor clusters were excluded from the differential expression test, and the LTi clusters were grouped together. For visualization of results, only cell lineages containing a cell type with > 0.25 cosine similarity with either Thetis cell or ILC3 clusters were plotted./p>

1.3, adjusted P < 0.01) identified in a one-vs-rest differential expression test for non-proliferating Thetis cell clusters (2–5), that were also expressed in the thymic epithelial cells. Among individual clusters of thymic epithelial cells defined in the original dataset, we identified 2 clusters of transit amplifying AIRE+ cells (clusters 25 and 26), distinguished by signature gene expression including cell cycle genes./p> 1.5, adjusted P < 0.01), we identified orthologous human genes that were uniquely mapped by gprofiler2 and computed enrichment scores for Thetis cell subset gene signatures for each human cell./p>0.001 of the sequence) were filtered. Regions from all groups were compiled and overlapping regions were merged to their union, resulting in a non-overlapping set of 176,942 peaks. A peak-by-cell count matrix was created by ArchR with a ‘ceiling’ value of 4 for the counts to avoid strong biases./p> 1 h at room temperature, postfixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated in acetone, and processed for Epon embedding. Ultrathin sections (60–65 nm) were counterstained with uranyl acetate and lead citrate. Images were taken with a transmission electron microscope (Tecnai G2–12; FEI) equipped with a digital camera (AMT BioSprint29)./p>

1.5, P < 0.01). d, Expression score of cell-cycle genes for each scRNA-seq cluster. e, Dot plot showing expression of myeloid genes. f, Flow cytometry of Zbtb46 (GFP) expression in ILC3 subsets from mLN of 3-week-old Zbtb46GFPRorgtcreR26lsl-tdTomato mice. Representative of n = 4 mice from two independent experiments. g-h, CellTypist derived cell labels for cell clusters from Fig. 2g, using a broad classification (g) or finer cell type annotation (h). i, Correspondence between cell labels for scATAC-seq and scRNA-seq./p>

1.5, adj. P < 0.01) between Aire+ mTEC and TC I. i, Bar graph showing log-normalized expression of Ptprc and Rorc genes in Aire+ mTECs and TCs. j, Flow cytometry of RORγt expression in Aire+ mTECs isolated from P18 RorcVenus-creERT2AireGFP mice. k, Heatmap reporting scaled expression values for top differentially expressed genes (FC > 1.5, adj. P < 0.01) between indicated SS2 clusters (f). Data in a,b are representative of > 3 independent experiments. Data in j representative of n = 5 mice from two independent experiments./p>